Малые рнк и рак. Большие дела небольших молекул: как малые РНК дирижируют генами бактерий Рибосвитч - датчик для бактерии

Статья на конкурс «био/мол/текст»: В последние годы РНК - а особенно ее «неклассические» разновидности - приковывает внимание биологов всего мира. Выяснилось, что регуляция с помощью некодирующих РНК широко распространена - начиная от вирусов и бактерий и заканчивая человеком. Изучение разнообразия малых бактериальных РНК-регуляторов ясно показало их важную роль как в промежуточном метаболизме, так и в адаптивных реакциях. В этой статье описаны разновидности малых РНК бактерий и механизмы регуляции, осуществляемые с их помощью. Особый акцент сделан на роли этих молекул в жизнедеятельности бактериальных агентов, вызывающих особо опасные инфекции .

РНК: больше, чем просто копия ДНК

Со школьной скамьи большинству читателей этого сайта известны основные механизмы работы живой клетки. В курсе биологии, начиная с законов Менделя и заканчивая ультрасовременными проектами по секвенированию геномов, красной нитью проходит идея магистральной генетической программы развития организма, известная профессиональным биологам как центральная догма молекулярной биологии . Она гласит, что молекула ДНК выступает носителем и хранителем генетической информации, которая через посредника - матричную РНК (мРНК), и при участии рибосомальной (рРНК) и транспортной РНК (тРНК), - реализуется в виде белков. Последние определяют видовой и индивидуальный фенотип .

Такое положение дел и отведение РНК роли второстепенного участника молекулярного спектакля сохранялось в научной среде вплоть до 80-х годов прошлого века. Пристальнее присмотреться к РНК заставили работы Т. Чека , показавшего, что РНК может выступать в роли катализатора химических реакций. Прежде считалось, что ускорение химических процессов в клетке - прерогатива ферментов , имеющих исключительно белковую природу. Открытие каталитической активности у РНК имело далеко идущие следствия - вкупе с более ранними теоретическими работами К. Вёзе и , оно позволило нарисовать возможную картину пребиотической эволюции на нашей планете. Дело в том, что с момента открытия у ДНК функции носителя генетической информации дилемма о том, что появилось в ходе эволюции раньше - ДНК или белок, необходимый для воспроизводства ДНК, - казалась почти столь же философской (то есть, беспредметной), как и вопрос о первенстве появления курицы или яйца. После открытия Т. Чека решение обрело вполне реальные очертания - была найдена молекула, обладающая свойствами как носителя информации, так и биокатализатора (пусть и в зачаточном виде). Со временем эти исследования переросли в целое направление в биологии, изучающее возникновение жизни через призму так называемого «мира РНК » .

Так стало очевидно, что древний мир РНК мог иметь отношение к зарождению и расцвету первичной жизни. Тем не менее, из этого вовсе не следует автоматически, что РНК у современных организмов - не архаизм, адаптированный под нужды внутриклеточных молекулярных систем, а действительно важный участник молекулярного ансамбля клетки. Лишь развитие молекулярных методов - в частности, секвенирования нуклеиновых кислот , - показало, что РНК истинно незаменимы в клетке, причем не только в виде канонической троицы «мРНК, рРНК, тРНК». Уже первые обширные данные по секвенированию ДНК указали на показавшийся поначалу труднообъяснимым факт - большая часть ее оказалась некодирующей - то есть, не несущей информацию о молекулах белка или «стандартных» РНК. Конечно, частично это можно приписать «генетическому мусору» - «выключенным» или утративших свою функцию фрагментам генома. Но сохранять такое количество «приданого» для биологических систем, старающихся тратить энергию экономно, кажется нелогичным.

И действительно, более детальные и тонкие методы исследования позволили обнаружить целый класс РНК-регуляторов экспрессии генов, частично заполняющих межгенное пространство. Еще до прочтения полных последовательностей геномов эукариот у круглого червя С. elegans были выделены микроРНК - молекулы небольшой длины (около 20 нуклеотидов), которые могут специфично связываться с участками мРНК по принципу комплементарности . Несложно догадаться, что в таких случаях с мРНК уже не прочесть информацию о кодируемых белках: рибосома просто не может «пробежаться» по такому, внезапно ставшему двухцепочечным, участку. Этот механизм подавления экспрессии гена, называемый РНК-интерференцией , уже был разобран на «биомолекуле» достаточно подробно . На сегодняшний день открыты тысячи молекул микроРНК и других некодирующих РНК (piRNA , snoRNA , nanoRNA и др.). У эукариот (в том числе, и у человека) они расположены в межгенных участках. Установлена важная их роль в клеточной дифференцировке, канцерогенезе, иммунном ответе и других процессах и патологиях .

Малые РНК - «троянский конь» для бактериальных белков

Несмотря на то, что некодирующие белок РНК у бактерий были открыты гораздо раньше первых аналогичных регуляторов у эукариот, их роль в метаболизме бактериальной клетки долгое время была завуалирована для научной общественности. Это объяснимо - традиционно бактериальная клетка считалась более примитивной и менее таинственной для исследователя структурой, сложность которой не идет ни в какое сравнение с нагромождением структур в клетке эукариотической. Более того, в геномах бактерий содержание некодирующей информации составляет лишь несколько процентов от общей длины ДНК, достигая максимум 40% у некоторых микобактерий. Но, учитывая, что микроРНК обнаружены даже у вирусов, у бактерий они должны играть важную регуляторную роль и подавно.

Оказалось, у прокариот существует довольно много малых РНК-регуляторов . Условно все они могут быть разделены на две группы:

1. Молекулы РНК, которые для осуществления свой функции должны связаться с белками.
2. РНК, комплементарно связывающиеся с другими РНК (составляют большинство известных регуляторных молекул РНК).

В первой группе выделяют малые РНК, для которых связывание с белком возможно, но необязательно. Известный пример - РНКаза Р (RNAse P), действующая как рибозим на «созревающую» тРНК. Однако если РНКаза Р может функционировать без белкового компонента, то для других малых РНК в этой группе связывание с белком обязательно (а сами они являются, по сути, кофакторами). Например, tmРНК активирует сложный белковый комплекс, выступая в роли «отмычки» для «застрявшей» рибосомы - в случае, если матричная РНК, с которой ведется считывание, подошла к концу, а стоп-кодон так и не повстречался.

Известен и еще более интригующий механизм непосредственного взаимодействия малых РНК с белками. В любой клетке широко распространены белки, связывающиеся с «традиционными» нуклеиновыми кислотами. Не является исключением и прокариотическая клетка. Например, ее гистоноподобные белки помогают корректно упаковать нить ДНК, а специфичные белки-репрессоры имеют сродство к операторной области бактериальных генов. Показано, что эти репрессоры могут ингибироваться малыми РНК, имитирующими «родные» для этих белков участки посадки на ДНК. Так, на малой РНК CsrB (рис. 1) есть 18 сайтов-«обманок» служащих тому, чтобы белок-репрессор CsrA не смог добраться до своей истинной мишени - гликогенового оперона. Между прочим, среди белков-репрессоров, «заблудившихся» из-за таких малых РНК, встречаются регуляторы глобальных метаболических путей, что позволяет многократно усиливать ингибирующий сигнал малой РНК. К примеру, так делает малая РНК 6S, «имитирующая» белковый фактор σ 70 . Конфигурационным «обманом» занимая центры связывания РНК-полимеразы с сигма-фактором, она запрещает экспрессию генов «домашнего хозяйства» .

Рисунок 1. Биоинформатически предсказанная вторичная структура малой РНК CsrB из Vibrio cholerae M66-2. Малые РНК - одноцепочечные молекулы, но, как и для других РНК, сворачивание (фолдинг) в стабильную пространственную структуру сопровождается формированием участков, где молекула гибридизуется сама на себя. Многочисленные изгибы на структуре в виде разомкнутых колец называются шпильками . В некоторых случаях комбинация шпилек позволяет РНК играть роль «губки», нековалентно связывая определенные белки. Но чаще молекулы такого типа интерферируют с ДНК или РНК; при этом пространственная структура малой РНК нарушается, и образуются новые участки гибридизации уже с молекулой-мишенью. Тепловая карта отражает вероятность того, что соответствующая пара нуклеотидов действительно будет связана внутримолекулярной водородной связью; для неспаренных участков - вероятность образовать водородные связи с какими-либо участками внутри молекулы. Изображение получено с помощью программы RNAfold .

Малые РНК бактерий интерферируют... и весьма успешно!

Механизм, по которому действуют регуляторы второй группы, в общем-то, схож с таковым у регуляторных РНК эукариот - это та же РНК-интерференция путем гибридизации с мРНК, только сами цепочки малых РНК зачастую подлиннее - до нескольких сотен нуклеотидов (см. рис. 1). В результате, из-за малой РНК рибосомы не могут считать информацию с мРНК. Хотя зачастую, похоже, не доходит и до этого: образовавшиеся комплексы «малая РНК - мРНК» становятся мишенью РНКаз (типа РНКазы Р) .

Компактность и плотность упаковки прокариотического генома дает о себе знать: если у эукариот большинство регуляторных РНК записаны в отдельных (чаще всего не кодирующих белок) локусах , то многие малые РНК бактерий могут кодироваться в том же участке ДНК, что и подавляемый ген, но на противолежащей цепи! Такие РНК называются цис-кодируемыми (антисмысловыми), а малые РНК, лежащие на некотором удалении от подавляемого участка ДНК - транс-кодируемыми . По-видимому, расположение цис-РНК можно считать торжеством эргономичности: они могут считываться с противолежащей цепи ДНК в момент ее расплетения одновременно с транскриптом-мишенью, что позволяет тонко управлять количеством синтезируемого белка.

Малые РНК в транс-положении эволюционируют независимо от целевой мРНК, и последовательность регулятора сильнее меняется в результате мутаций. Возможно, такой расклад бактериальной клетке только «на руку», поскольку малая РНК приобретает активность в отношении ранее несвойственных ей мишеней, что сокращает время и энергетические затраты на создание других регуляторов. С другой стороны, давление отбора не позволяет транс-малой РНК мутировать слишком сильно, поскольку она потеряет активность. Тем не менее, для гибридизации с матричной РНК большинству транс-малых РНК необходим помощник - белок Hfq. По-видимому, в противном случае неполная комплементарность малой РНК может создавать проблемы для связывания с мишенью.

По-видимому, потенциально реализуемый механизм регуляции по принципу «одна малая РНК - множество мишеней» помогает интегрировать метаболические сети бактерии, что крайне необходимо в условиях короткой одноклеточной жизни. Можно продолжить спекуляцию на тему и предположить, что с помощью транс-кодируемых малых РНК осуществляется пересылка экспрессионных «предписаний» из функционально связанных, но физически удаленных локусов. Необходимостью в подобного рода генетической «перекличке» логично объясняется большое количество малых РНК, обнаруженных у патогенных бактерий. Например, несколько сотен малых РНК найдено у рекордсмена по этому показателю - холерного вибриона (Vibrio cholerae ). Это микроорганизм, который умеет выживать и в окружающей водной среде (как пресной, так и соленой), и на водных моллюсках, и в рыбе, и в кишечнике человека - тут без комплексной адаптации с помощью регуляторных молекул никак не обойтись!

CRISPR на страже бактериального здоровья

Нашлось применение малым РНК и в решении другой насущной для бактерий задаче. Даже самые злостные патогенные кокки и палочки могут оказаться бессильны перед лицом опасности, исходящей от особых вирусов - бактериофагов, способных молниеносно истребить бактериальную популяцию. У многоклеточных организмов для защиты от вирусов существует специализированная система - иммунная , средствами клеток и выделяемых ими веществ охраняющая организм от незваных гостей (в том числе, вирусной природы). Бактериальная клетка - одиночка, но она не так уязвима, как может показаться на первый взгляд. Хранителями рецептов для поддержания противовирусного иммунитета бактерий выступают локусы CRISPR - кластерные регулярно-прерывистые короткие палиндромные повторы (clustered regularly interspaced short palindromic repeats ) (рис. 2; ). В геномах прокариот каждая CRISPR-кассета представлена лидерной последовательностью длиной несколько сотен нуклеотидов, за которой следует серия из 2–24 (иногда до 400) повторов, разделенных спейсерными участками, схожими между собой по длине, но уникальными по нуклеотидной последовательности. Длина каждого спейсера и повтора не превышает сотню пар нуклеотидов .

Рисунок 2. CRISPR-локус и процессинг соответствующей ему малой РНК до функционального транскрипта. В геноме CRISPR -кассета представлена перемежающимися между собой спейсерами (на рисунке обозначены как Сп ), частично гомологичными участкам фаговой ДНК, и повторами (По ) длиной 24–48 п.н., демонстрирующими диадную симметрию . В противоположность повторам, спейсеры внутри одного локуса одинаковы по длине (у разных бактерий это может быть 20–70 нуклеотидов), но отличаются по нуклеотидной последовательности. Участки «-спейсер-повтор-» могут быть достаточно протяженными и состоять из нескольких сотен звеньев. Вся структура фланкируется с одной стороны лидерной последовательностью (ЛП , несколько сотен пар оснований). Неподалеку находятся Cas-гены (C RISPR -as sociated), организованные в оперон. Белки, считываемые с них, выполняют ряд вспомогательных функций, обеспечивая процессинг транскрипта, считанного с CRISPR -локуса, его успешную гибридизацию с фаговой ДНК-мишенью, встраивание новых элементов в локус и т.д. Образующаяся в результате многоэтапного процессинга СrRNA гибридизуется с участком ДНК (нижняя часть рисунка), впрыскиваемой фагом в бактерию. Это заставляет «замолчать» транскрипционную машину вируса и останавливает его размножение в прокариотической клетке.

Детальный механизм возникновения всего CRISPR -локуса еще предстоит изучить. Но на сегодняшний день предложена принципиальная схема возникновения спейсеров - важнейших структур в его составе. Оказывается, «охотники за бактериями» оказываются биты их же оружием - нуклеиновыми кислотами, а точнее - «трофейной» генетической информацией, полученной бактериями от фагов в прежних сражениях! Дело в том, что не все фаги, попавшие в бактериальную клетку, оказываются гибельными. ДНК таких фагов (возможно, относящихся к умеренным) режется специальными Cas-белками (их гены фланкируют CRISPR ) на мелкие фрагменты. Часть этих фрагментов будет встроена в CRISPR -локусы «хозяйского» генома. И когда фаговая ДНК вновь попадает в бактериальную клетку, она встречается с малой РНК из CRISPR -локуса, в тот момент экспрессируемой и обрабатываемой Cas-белками. Вслед за этим происходит инактивация вирусной генетической информации по уже описанному выше механизму РНК-интерференции .

Из гипотезы формирования спейсеров неясно, зачем между ними нужны повторы, внутри одного локуса незначительно отличающиеся по длине, но практически идентичные по последовательности? Здесь открывается широкий простор для фантазии. Быть может, без повторов было бы проблематично осуществить разбиение генетических данных на смысловые фрагменты, подобные секторам на жестком диске компьютера, и тогда доступ транскрипционной машины к строго определенным участкам CRISPR -локуса стал бы затруднительным? А быть может, повторы упрощают рекомбинационные процессы при встраивании новых элементов фаговой ДНК? Или же они - «знаки препинания», без которых не обойтись при процессинге CRISPR? Как бы то ни было, биологическая причина, объясняющая поведение бактериальной клетки на манер гоголевского Плюшкина, в свое время будет найдена.

CRISPR , будучи «летописью» взаимоотношений бактерии с фагом, может использоваться в филогенетических исследованиях. Так, недавно осуществленное типирование по CRISPR позволило окинуть взглядом эволюцию отдельных штаммов чумного микроба (Yersinia pestis ). Исследование их CRISPR -«родословных» пролило свет на события полутысячелетней давности, когда штаммы проникли в Монголию с территории, в настоящее время относящейся к Китаю . Но не для всех бактерий, и, в частности, патогенов, данный метод применим. Несмотря на недавние сведения о предсказанных CRISPR-обрабатывающих белках у возбудителей туляремии (Francisella tularensis ) и холеры , сами CRISPR, если и присутствуют в их геноме, то немногочисленны. Возможно, фаги, учитывая их положительный вклад в приобретение вирулентности патогенными представителями бактериального царства, не так уж вредны и опасны, чтобы обороняться от них с помощью CRISPR? Или же вирусы, атакующие эти бактерии, слишком многообразны, и стратегия «интерферирующего» РНК-иммунитета в отношении них бесплодна?

Рисунок 3. Некоторые механизмы работы рибосвитчей. Рибосвитчи (рибопереключатели) встроены в матричную РНК, но отличаются большой свободой конформационного поведения, зависящего от специфичных лигандов, что дает основание считать рибосвитчи самостоятельными единицами малых РНК. Изменение конформации экспрессионной платформы влияет на сайт посадки рибосомы на мРНК (RBS ), и, как следствие, определяет доступность всей мРНК для считывания. Рибосвитчи в известной степени аналогичны операторной области в классической модели lac -оперона - но только аптамерные участки обычно регулируются низкомолекулярными веществами и осуществляют переключение работы гена на уровне мРНК, а не ДНК. а - В отсутствие лигандов рибосвитчи btuB (кобаламинового транспортера) и thiM (тиаминпирофосфат-зависимый) , осуществляющие ненуклеолитическую репрессию мРНК, «включаются» (ON ) и позволяют рибосоме заняться своим делом. Связывание лиганда с рибосвитчем (OFF -положение) приводит формированию шпильки, делающей этот участок недоступным для рибосомы. б - Лизиновый рибосвитч lysC при отсутствии лиганда также включен (ON ). Выключение рибосвитча блокирует рибосоме доступ к мРНК. Но в отличие от описанных выше рибосвитчей, в лизиновом при выключении «оголяется» участок, разрезаемый специальным РНКазным комплексом (degradosome ), и вся мРНК утилизируется, распадаясь на мелкие фрагменты. Репрессия рибосвитчем в данном случае называется нуклеолитической (nucleolytic ) и необратима, поскольку, в отличие от примера (а ), обратное переключение (снова в ON ) уже невозможно. Важно отметить, что таким образом может достигаться утилизация группы «ненужных» мРНК: рибосвитч похож на деталь детского конструктора, и схожие по структуре переключатели могут иметься у целой группы функционально связанных матричных молекул.

Рибосвитч - датчик для бактерии

Итак, есть белок-ассоциирующие малые РНК, есть малые РНК, интерферирующие с собственными мРНК бактерий, а также РНК, захваченные бактериями из вирусов и подавляющие фаговую ДНК. Разве можно вообразить какой-нибудь еще механизм регуляции с помощью малых РНК? Оказывается, да. Если проанализировать описанное выше, то обнаружится, что во всех случаях антисмысловой регуляции наблюдается интерференция малой РНК и мишени как результат гибридизации двух отдельных молекул. А почему бы не расположить малую РНК в составе самого транскрипта ? Тогда можно, изменяя конформацию такого «засланного казачка» внутри мРНК, менять доступность всей матрицы для считывания при трансляции или же, что энергетически еще более целесообразно, регулировать биосинтез мРНК, т.е. транскрипцию!

Такие структуры широко представлены в бактериальных клетках и известны как рибосвитчи (riboswitch ). Они располагаются перед началом кодирующей части гена, на 5′-конце мРНК. Условно в составе рибосвитчей можно выделить два структурных мотива: аптамерный участок , ответственный за связывание с лигандом (эффектором), и экспрессионную платформу , обеспечивающую регуляцию экспрессии гена посредством перехода мРНК в альтернативные пространственные структуры . Например, такой переключатель («выключающего» типа) используется для функционирования лизинового оперона : при избытке лизина он существует в виде «запутанной» пространственной структуры, блокирующей считывание с оперона, а при его нехватке рибосвитч «расплетается», и синтезируются белки, необходимые для биосинтеза лизина (рис. 3).

Описанная принципиальная схема устройства рибосвитча - не канон, существуют варианты. Любопытный «включающий» тандемный рибосвитч обнаружен у холерного вибриона: экспрессионной платформе предшествуют сразу два аптамерных участка. Очевидно, это обеспечивает бóльшую чувствительность и более плавный ответ на появление в клетке еще одной аминокислоты - глицина . Возможно, косвенно причастен к высокой выживаемости бактерии схожий по принципу действия, но «двойной» рибосвитч в геноме возбудителя сибирской язвы (Bacillus anthracis ). Он реагирует на входящее в состав минимальной среды жизненно важное для этого микроба соединение - тиаминпирофосфат .

Помимо переключения метаболических путей в зависимости от доступного для бактериальной клетки «меню», рибосвитчи могут быть датчиками гомеостаза бактерии. Так, они были замечены в регуляции доступности гена для считывания при нарушении функционирования трансляционной системы внутри клетки (например, такие сигналы как появление «незаряженных» тРНК и «неисправных» (stalled) рибосом), либо при изменении факторов внешней среды (например, повышении температуры) .

Не нужно белков, дайте нам РНК!

Так что же означает присутствие такого разнообразия малых РНК-регуляторов внутри бактерии? Свидетельствует ли это об отказе от концепции, когда главными «управленцами» являются белки, или мы наблюдаем очередной модный тренд? Видимо, ни то, и ни другое. Конечно, некоторые малые РНК являются глобальными регуляторами метаболических путей - как упомянутая CsrB, участвующая, вкупе с CsrС, в регуляции запасания органического углерода. Но, принимая во внимание принцип дублирования функций в биологических системах, малые РНК бактерий можно сравнить скорее с «антикризисным менеджером», чем с генеральным директором. Так, в условиях, когда для выживания микроорганизма нужно быстро перенастроить внутриклеточный метаболизм, их регуляторная роль может оказаться решающей и более эффективной, чем у белков с аналогичными функциями. Таким образом, РНК-регуляторы отвечают, скорее, за экспресс-реагирование, менее стойкое и надежное, чем в случае с белками: не следует забывать, что малая РНК поддерживает свою 3D-структуру и удерживается на ингибируемой матрице слабыми водородными связями.

Косвенным подтверждением этих тезисов могут стать уже упоминавшиеся малые РНК холерного вибриона. Для этой бактерии попадание в организм человека - не желанная цель, а, видимо, чрезвычайная ситуация. Выработка токсинов и активация других, связанных с вирулентностью, путей в данном случае - всего лишь защитная реакция на агрессивное противодействие среды и клеток организма «чужакам». «Спасателями» здесь выступают малые РНК - например Qrr, помогающие вибриону в стрессовых условиях модифицировать стратегию выживания, изменяя коллективное поведение . Косвенно подтвердить эту гипотезу может также открытие малой РНК VrrA, активно синтезирующейся при нахождении вибрионов в организме и подавляющей наработку мембранных белков Omp . «Спрятанные» мембранные белки в начальной фазе инфицирования, возможно, помогают избежать мощного иммунного ответа со стороны организма человека (рис. 4).

Рисунок 4. Малые РНК в реализации патогенных свойств холерного вибриона. а - Холерный вибрион хорошо чувствует себя и прекрасно размножается в водной среде. Организм человека, вероятно, не является основной экологической нишей для этого микроба. б - Попадая по водному или пищевому пути передачи инфекции в агрессивную среду - тонкий кишечник человека, - вибрионы по организованности поведения начинают напоминать псевдоорганизм, основная задача которого - сдержать иммунный ответ и создать себе благоприятную среду для колонизации. Большое значение в координации действий внутри популяции бактерий и их взаимодействия с организмом отводится мембранным везикулам. До конца неизученные факторы среды в кишечнике являются сигналами для экспрессии в вибрионах малых РНК (например, VrrA). В результате запускается механизм образования везикул, являющихся неиммунногенными при низком числе клеток вибриона в кишечнике. Дополнительно к описанному эффекту малые РНК помогают «спрятать» потенциально провокационные для иммунной системы человека мембранные белки Omp. При косвенном участии малых РНК Qrr1-4 запускается интенсивная выработка холерного токсина (не показано на рисунке), что дополняет спектр адаптивных реакций холерного вибриона. в - Уже через несколько часов количество бактериальных клеток возрастает, а пул малых РНК VrrA уменьшается, что, вероятно, приводит к экспонированию мембранных белков. Количество «пустых» везикул также постепенно уменьшается, и на этом этапе они заменяются на иммунногенные, доставляемые в энтероциты . Видимо, это часть «плана» по реализации комплексного сигнала, смысл которого - спровоцировать эвакуацию вибрионов из организма человека. NB: соотношение размеров бактериальных клеток и энтероцитов не соблюдено.

Интересно проследить, как изменятся наши представления о малых РНК-регуляторах, когда будут получены новые данные на платформах RNAseq, в том числе, по свободноживущим и некультивируемым формам. Недавние работы с использованием «глубокого секвенирования» уже дали неожиданные результаты, указав на наличие микроРНК-подобных молекул у мутантных стрептококков . Конечно, такие данные нуждаются в тщательной перепроверке, но, как бы то ни было, можно с уверенностью утверждать, что изучение малых РНК у бактерий преподнесет немало сюрпризов.

Благодарности

Оригинальные идеи и композиционное оформление при создании заглавного рисунка, а также рисунка 4 принадлежат выпускнице ИархиИ ЮФУ Копаевой Е.А. Наличие в статье рисунка 2 - заслуга доцента каф. зоологии ЮФУ Г.Б. Бахтадзе. Он же осуществил научную корректуру и доработку заглавного рисунка и рисунка 4. Автор выражает им огромную признательность за терпение и творческий подход к делу. Отдельная благодарность коллеге, с.н.с. лаб. биохимии микробов Ростовского противочумного института Сорокину В.М. за обсуждение текста статьи и высказанные ценные замечания.

Литература

1. Карл Вёзе (1928–2012) ;;. 80 , 1148-1154;
2. R. R. Breaker. (2012). Riboswitches and the RNA World . Cold Spring Harbor Perspectives in Biology . 4 , a003566-a003566;
3. J. Patrick Bardill, Brian K. Hammer. (2012). Non-coding sRNAs regulate virulence in the bacterial pathogen Vibrio cholerae . RNA Biology . 9 , 392-401;
4. Heon-Jin Lee, Su-Hyung Hong. (2012). Analysis of microRNA-size, small RNAs in Streptococcus mutans by deep sequencing . FEMS Microbiol Lett . 326 , 131-136;
5. M.-P. Caron, L. Bastet, A. Lussier, M. Simoneau-Roy, E. Masse, D. A. Lafontaine. (2012). Dual-acting riboswitch control of translation initiation and mRNA decay . Proceedings of the National Academy of Sciences . 109 , E3444-E3453.

В живой клетке поток информации между ядром и цитоплазмой никогда не иссякает, однако понимание всех его «завихрений» и расшифровка закодированной в нём информации - воистину титаническая задача. Одним из важнейших рывков в биологии прошлого века можно считать открытие молекул информационных (или матричных) РНК (иРНК или мРНК), которые служат посредниками, переносящими информационные «сообщения» из ядра (с хромосом) в цитоплазму. Определяющая роль РНК в синтезе белков была предсказана ещё в 1939 году в работе Торбьёрна Касперссона (Torbjörn Caspersson ), Жана Брачета (Jean Brachet ) и Джека Шульца (Jack Schultz ), а в 1971 году Джордж Марбайс (George Marbaix ) запустил синтез гемоглобина в ооцитах лягушки, сделав инъекцию впервые выделенной матричной РНК кролика, кодирующей этот белок .

В 1956–1957 годах в Советском Союзе А. Н. Белозерский и А. С. Спирин независимо доказали существование мРНК, а также выяснили, что основную массу РНК в клетке составляет отнюдь не матричная, а рибосомальная РНК (рРНК). Рибосомальная РНК - второй «главный» вид клеточной РНК - образует «скелет» и функциональный центр рибосом у всех организмов; именно рРНК (а не белки) регулирует основные этапы белкового синтеза. Одновременно был описан и изучен и третий «главный» вид РНК - транспортные РНК (тРНК), которые в комплексе с двумя другими - мРНК и рРНК - формируют единый белок-синтезирующий комплекс. Согласно достаточно популярной гипотезе «мира РНК», именно эта нуклеиновая кислота лежала у самых истоков жизни на Земле .

В связи с тем, что РНК значительно более гидрофильна по сравнению с ДНК (за счет замены дезоксирибозы на рибозу), она более лабильна и может относительно свободно перемещаться в клетке, а значит и доставлять короткоживущие реплики генетической информации (мРНК) к месту, где начинается белковый синтез. Однако стоит отметить и связанное с этим «неудобство» - РНК очень нестабильна. Она намного хуже, чем ДНК, хранится (даже внутри клетки) и деградирует при малейшей перемене условий (температура, рН). Кроме «собственной» нестабильности, большой вклад принадлежит рибонуклеазам (или РНКазам) - классу расщепляющих РНК ферментов, очень стабильных и «вездесущих» - даже кожа рук экспериментатора содержит достаточное количество этих ферментов, чтобы перечеркнуть весь эксперимент. Из-за этого работать с РНК намного сложнее, чем с белками или ДНК - последняя вообще может храниться сотни тысяч лет практически без повреждений .

Фантастическая аккуратность при работе, тридисстилят, стерильные перчатки, одноразовая лабораторная посуда - всё это необходимо для предотвращения деградации РНК, однако соблюдение таких стандартов не всегда было возможным. Поэтому долгое время на короткие «обломки» РНК, неизбежно загрязнявшие растворы, попросту не обращали внимания. Однако со временем стало ясно, что, несмотря на все усилия по поддержанию стерильности рабочей области, «обломки» закономерно продолжали обнаруживаться, а потом выяснилось, что в цитоплазме всегда присутствуют тысячи коротких двуцепочечных РНК, выполняющих вполне определённые функции, и абсолютно необходимых для нормального развития клетки и организма.

Принцип РНК-интерференции

Возможностью применения киРНК заинтересовались и фармацевты, поскольку способность направленной регуляции работы отдельных генов сулит неслыханные перспективы в лечении массы заболеваний. Небольшой размер и высокая специфичность действия обещают высокую эффективность и низкую токсичность лекарств на основе киРНК; однако решить проблему доставки киРНК к больным клеткам в организме пока не удалось - виной тому хрупкость и недолговечность этих молекул. И хотя сейчас десятки коллективов пытаются найти способ направлять эти «волшебные пули» точно в цель (внутрь больных органов), видимых успехов они пока не достигли. Кроме этого, есть и другие сложности. Например, в случае антивирусной терапии высокая избирательность действия киРНК может оказать «медвежью услугу» - поскольку вирусы быстро мутируют, изменённый штамм очень быстро потеряет чувствительность к киРНК, подобранной в начале терапии: известно, что замена всего лишь одного нуклеотида в киРНК приводит к существенному снижению эффекта интерференции.

В этом месте стоит напомнить ещё раз - киРНК были обнаружены только у растений, беспозвоночных и одноклеточных ; хотя гомологи белков для РНК-интерференции (Dicer, RISC-комплекс) присутствуют и у высших животных, киРНК привычными методами не обнаруживались. Каково же было удивление, когда искусственно введённые синтетические аналоги киРНК вызывали сильный специфический дозозависимый эффект в культурах клеток млекопитающих! Это означало, что в клетках позвоночных РНК-интерференция не заместилась более сложными системами иммунитета, а эволюционировала вместе с организмами, превратившись во что-то более «продвинутое». Следовательно, у млекопитающих надо было искать не точные аналоги киРНК, а их эволюционных преемников.

Игрок № 2 - микроРНК

Действительно, на основе эволюционно достаточно древнего механизма РНК-интерференции у более развитых организмов появились две специализированные системы управления работой генов, использующие каждая свою группу малых РНК - микроРНК (microRNA) и пиРНК (piRNA , Piwi-interacting RNA). Обе системы появились ещё у губок и кишечнополостных и эволюционировали вместе с ними, вытеснив киРНК и механизм «голой» РНК-интерференции. Их роль в обеспечении иммунитета снижается, поскольку эту функцию взяли на себя более совершенные механизмы клеточного иммунитета, - в частности, интерфероновая система . Однако эта система настолько чувствительна, что срабатывает и на саму киРНК: появлении в клетке млекопитающих малых двуцепочечных РНК запускает «сигнал тревоги» (активирует секрецию интерферона и вызывает экспрессию интерферон-зависимых генов, что блокирует все процессы трансляции целиком). В этой связи механизм РНК-интерференции у высших животных опосредован в основном микроРНК и пиРНК - одноцепочечными молекулами со специфической структурой, которая не обнаруживаются интерфероновой системой.

По мере усложнения генома микроРНК и пиРНК принимали всё большее участие в регуляции транскрипции и трансляции. Со временем, они превратились в дополнительную, точную и тонкую систему регуляции генома. В отличие от киРНК, микроРНК и пиРНК (открыты в 2001 году, см. врезку 3) не производятся из чужеродных двуцепочечных молекул РНК, а изначально закодированы в геноме организма-хозяина .

Встречайте: микроРНК

Предшественник микроРНК транскрибируется с обеих цепей геномной ДНК РНК-полимеразой II , в результате чего появляется промежуточная форма - при-микроРНК, - несущая признаки обычной мРНК - m 7 G-кэп и полиА-хвост. В этом предшественнике образуется петля с двумя одноцепочечными «хвостами» и несколькими неспаренными нуклеотидами в центре (рис. 3). Такая петля подвергается двухстадийному процессингу (рис. 4): вначале эндонуклеаза Drosha отрезает от шпильки одноцепочечные «хвосты» РНК, после чего вырезанная шпилька (пре-микроРНК) экспортируется в цитоплазму, где узнается Dicer’ом, вносящим ещё два разреза (вырезается двуцепочечный участок, обозначенный цветом на рис. 3). В таком виде зрелая микроРНК, аналогично киРНК, включается в состав комплекса RISC.

Рисунок 3. Структура двуцепочечной молекулы-предшественника микроРНК. Основные особенности: наличие консервативных последовательностей, которые формируют шпильку; наличие комплементарной копии (микроРНК*) с двумя «лишними» нуклеотидами на 3′-конце; специфическая последовательность (2–8 п. н.), формирующая сайт узнавания для эндонуклеаз. Сама микроРНК выделена красным цветом - именно её и вырезает Dicer.

Механизм действия многих микроРНК аналогичен действию киРНК: короткая (21–25 нуклеотидов) одноцепочечная РНК в составе белкового комплекса RISC с высокой специфичностью связывается с комплементарным участком в 3′-нетранслируемой области мРНК-мишени. Связывание приводит к расщеплению мРНК белком Ago. Однако активность микроРНК (по сравнению с киРНК) уже более дифференцирована - если комплементарность не абсолютная, целевая мРНК может не деградировать, а только обратимо блокироваться (трансляции не будет). Тот же RISC-комплекс может использовать и искусственно введённые киРНК. Это объясняет, почему киРНК, сделанные по аналогии с простейшими, активны и у млекопитающих.

Таким образом, мы можем дополнить иллюстрацию механизма действия РНК-интерференции у высших (билатерально-симметричных) организмов, объединив на одном рисунке схему действия микроРНК и биотехнологически введённых киРНК (рис. 5).

Рисунок 5. Обобщённая схема действия искусственных микроРНК и киРНК (искусственные киРНК вводятся в клетку с помощью специализированных плазмид - targeting siRNA vector ).

Функции микроРНК

Физиологические функции микроРНК крайне разнообразны - фактически, они выступают основными небелковыми регуляторами онтогенеза. микроРНК не отменяют, а дополняют «классическую» схему регуляцию генов (индукторы, супрессоры, компактизация хроматина и т. д.). Кроме того, синтез самих микроРНК сложным образом регулируются (определенные пулы микроРНК могут включаться интерферонами, интерлейкинами, фактором некроза опухолей α (ФНО-α) и многими другими цитокинами). В результате вырисовывается потрясающая по своей сложности и гибкости многоуровневая сеть настройки «оркестра» из тысяч генов, но и этим дело не заканчивается.

микроРНК более «универсальны», чем киРНК: «подопечные» гены не обязательно должны быть на 100% комплементарны - регуляция осуществляется и при частичном взаимодействии. На сегодня одна из самых горячих тем в молекулярной биологии - поиск микроРНК, которые выступают альтернативными регуляторами известных физиологических процессов. Например, уже описаны микроРНК, участвующие в регуляции клеточного цикла и апоптоза у растений, дрозофилы и нематоды; у человека микроРНК регулируют иммунную систему и развитие гематопоэтических стволовых клеток . Применение технологий на основе биочипов (micro-array screening) показало, что на различных этапах жизни клеток включаются и выключаются целые пулы малых РНК. Для биологических процессов идентифицировали десятки специфичных микроРНК, уровень экспрессии которых в определённых условиях изменяется в тысячи раз, подчёркивая исключительную управляемость этих процессов.

До недавнего времени считалось, что микроРНК только подавляют - полностью или частично - работу генов. Однако недавно оказалось: действие микроРНК может кардинально отличаться в зависимости от состояния клетки! В активно делящейся клетке микроРНК, связавшись с комплементарной последовательностью в 3′-участке мРНК, ингибирует синтез белка (трансляцию). Однако в состоянии покоя или стресса (например, при росте на бедной среде) то же самое событие приводит к прямо противоположному эффекту - усилению синтеза целевого белка !

Эволюция микроРНК

Количество разновидностей микроРНК у высших организмов ещё до конца не установлено - по некоторым данным, оно превосходит 1% от числа белок-кодирующих генов (у человека, например, говорят о 700 микроРНК, и это число постоянно растет). микроРНК регулируют активность около 30% всех генов (мишени для многих из них пока не известны), причём существуют как повсеместно распространённые, так и тканеспецифичные молекулы - например, один такой важный пул микроРНК регулирует созревание стволовых клеток крови.

Широкий профиль экспрессии в разных тканях разных организмов и биологическая распространённость микроРНК говорит об эволюционно древнем происхождении. Впервые микроРНК обнаружили у нематод, и долгое время потом считали, что эти молекулы появляются лишь у губок и кишечнополостных; однако позже их открыли и в одноклеточных водорослях . Интересно, что по мере усложнения организмов увеличивается также количество и гетерогенность пула микроРНК. Это косвенно свидетельствует о том, что сложность этих организмов обеспечивается, в частности, функционированием микроРНК . Возможная эволюция микроРНК показана на рисунке 6.

Рисунок 6. Многообразие микроРНК у разных организмов. Чем выше организация организма, тем больше у него обнаруживается микроРНК (число в скобках). Красным выделены виды, у которых обнаружены единичные микроРНК.

Между киРНК и микроРНК можно провести чёткую эволюционную связь, опираясь на следующие факты:

• действие обоих видов взаимозаменяемо и опосредуется гомологичными белками;
• киРНК, введённые в клетки млекопитающих, специфично «выключают» нужные гены (несмотря на некоторую активацию интерфероновой защиты);
• микроРНК обнаруживаются у всё более и более древних организмов.

Эти и другие данные позволяют предположить происхождение обеих систем от общего «предка». Интересно также отметить, что «РНКовый» иммунитет как независимый предшественник белковых антител подтверждает теорию зарождения первых форм жизни на основе РНК, а не белков (напомним, что это любимая теория академика А. С. Спирина ).

Чем дальше, тем запутанней. Игрок № 3 - пиРНК

Пока на арене молекулярной биологии было только два «игрока» - киРНК и микроРНК - основное «предназначение» РНК-интерференции казалось совершенно понятным. Действительно: набор гомологичных коротких РНК и белков у разных организмов осуществляет аналогичные действия; по мере усложнения организмов усложняется и функциональность.

Однако в процессе эволюции природа создала ещё одну, эволюционно самую позднюю и узкоспециализированную систему на основе всё того же удачного принципа РНК-интерференции. Речь идет пиРНК (piRNA , от Piwi-interaction RNA ).

Чем сложнее организован геном, тем более развит и приспособлен организм (или наоборот? ;-). Однако увеличение сложности генома имеет и оборотную сторону: сложная генетическая система становится нестабильной . Это ведет к необходимости механизмов, отвечающих за поддержание целостности генома - иначе самопроизвольное «перемешивание» ДНК просто выведет её из строя. Мобильные генетические элементы (МГЭ ) - один из основных факторов нестабильности генома - представляют собой короткие нестабильные участки, которые могут автономно транскрибироваться и мигрировать по геному. Активация таких мобильных элементов приводит к множественным разрывам ДНК в хромосомах, чреватых летальными последствиями.

Количество МГЭ нелинейно увеличивается с размером генома, и их активность необходимо сдерживать. Для этого животные, уже начиная с кишечнополостных, используют всё тот же феномен РНК-интерференции. Эту функцию также выполняют короткие РНК, однако не те, о которых речь уже шла, а третий их тип - пиРНК.

«Портрет» пиРНК

Функции пиРНК

Главная функция пиРНК - подавление активности МГЭ на уровне транскрипции и трансляции. Считается, что пиРНК активны только во время эмбриогенеза, когда непредсказуемые перетасовки генома особенно опасны и могут привести к гибели зародыша. Это логично - когда иммунная система ещё не заработала, клетки эмбриона нуждаются в какой-нибудь простой, но действенной защите. От внешних патогенов эмбрион надежно защищен плацентой (или оболочкой яйца). Но кроме этого необходима оборона и от эндогенных (внутренних) вирусов, - в первую очередь МГЭ.

Эта роль пиРНК подтверждена опытом - «нокаут» или мутации генов Ago3, Piwi или Aub приводят к серьёзным нарушениям развития (и резкому увеличению числа мутаций в геноме такого организма), а также вызывают бесплодие за счёт нарушения развития половых клеток.

Распространение и эволюция пиРНК

Первые пиРНК обнаруживаются уже у актиний и губок. Растения, видимо, пошли другим путём - белки Piwi у них не обнаружены, а роль «намордника» для транспозонов выполняют эндонуклеаза Ago4 и киРНК.

У высших животных - в том числе и человека - система пиРНК развита очень хорошо, но встретить её можно только в эмбриональных клетках и в околоплодном эндотелии. Почему распространение пиРНК в организме столь ограничено - ещё предстоит узнать. Можно предположить, что, как и любое мощное оружие, пиРНК приносит пользу только в очень специфических условиях (во время развития плода), а во взрослом организме их активность нанесёт больше вреда, чем пользы. Все-таки, число пиРНК на порядок превосходит количество известных белков - и неспецифические эффекты пиРНК в зрелых клетках сложно предсказать.

Таблица 1. Свойства всех трёх классов коротких РНК

	киРНК	микроРНК	пиРНК
Распространение	Растения, Drosophila , C. elegans . Не найдено у позвоночных	Эукариоты	Эмбриональные клетки животных (начиная с кишечнополостных). Нет у простейших и растений
Длина	21–22 нуклеотидов	19–25 нуклеотидов	24–30 нуклеотидов
Структура	Двуцепочечная, по 19 комплементарных нуклеотидов и два неспаренных нуклеотида на 3′-конце	Одноцепочечная сложная структура	Одноцепочечная сложная структура. U на 5′-конце, 2’-O -метилированный 3′-конец
Процессинг	Dicer-зависимый	Dicer-зависимый	Dicer-независимый
Эндонуклеазы	Ago2	Ago1, Ago2	Ago3, Piwi, Aub
Активность	Деградация комплементарных мРНК, ацетилирование геномной ДНК	Деградация или ингибирование трансляции целевой мРНК	Деградация мРНК, кодирующих МГЭ, регуляция транскрипции МГЭ
Биологическая роль	Антивирусная иммунная защита, подавление активности собственных генов	Регуляция активности генов	Подавление активности МГЭ во время эмбриогенеза

Заключение

В заключение хочется привести таблицу, иллюстрирующую эволюцию белкового аппарата, участвующего в РНК-интерференции (рис. 9). Видно, что у простейших наиболее развита система киРНК (белковые семейства Ago, Dicer), а с усложнением организмов акцент переносится на более специализированные системы - увеличивается число изоформ белков для микроРНК (Drosha, Pasha) и пиРНК (Piwi, Hen1). При этом разнообразие ферментов, опосредующих действие киРНК, уменьшается.

Рисунок 9. Многообразие белков, участвующих в РНК-интерференции (цифры обозначают количество белков каждой группы). Синим цветом подсвечены элементы, характерные для киРНК и микроРНК, а красным - белки , связанные с пиРНК.

Явление РНК-интерференции начали использовать уже простейшие организмы. На основе этого механизма природа создала прототип иммунной системы, а по мере усложнения организмов РНК-интерференция становится незаменимым регулятором активности генома. Два разных механизма плюс три вида коротких РНК (см. таб. 1) - в результате мы видим тысячи тонких регуляторов различных метаболических и генетических путей. Эта поразительная картина иллюстрирует универсальность и эволюционную адаптацию молекулярных биологических систем. Короткие РНК снова доказывают, что «мелочей» внутри клетки нет - есть только мелкие молекулы, всю значимость роли которых мы только начинаем понимать.

(Правда, такая фантастическая сложность говорит скорее о том, что эволюция «слепа» и действует без наперёд утверждённого «генерального плана» »;

Andrew Grimson, Mansi Srivastava, Bryony Fahey, Ben J. Woodcroft, H. Rosaria Chiang, et. al.. (2008). Early origins and evolution of microRNAs and Piwi-interacting RNAs in animals . Nature . 455 , 1193-1197;

A. A. Aravin, G. J. Hannon, J. Brennecke. (2007). The Piwi-piRNA Pathway Provides an Adaptive Defense in the Transposon Arms Race . Science . 318 , 761-764;

Разрушение целевой мРНК может происходить также под действием малых интерферирующих РНК (Small interfering RNA, siRNA). Интерференция РНК - одно из новых революционных открытий в молекулярной биологии, а его авторы в 2002 г получили за него Нобелевскую премию. Интерферирующие РНКрезко отличаются по строению от других типов РНК и представляют собой две комплиментарные молекулы РНК длиной примерно в 21-28 азотистых основа­ний, которые соединены друг с другом как нити в молекуле ДНК. При этом по краям каждой из цепей siRNA всегда остается два неспаренных нуклеотида. Воздействие осуществляется следующим образом. Когда молекула siRNA оказыва­ется внутри клетки, она на первом этапе связывается в комплекс с двумя внутриклеточными ферментами - хеликазой и нуклеазой. Этот комплекс получил название RISC (R NA-i nduced s ilencing c omplex; silence - англ. молчать, замолкать; silencing - замолкание, так в англоязычной и специальной литературе называют процесс "выключения" гена). Далее хеликаза расплетает и разъединяет нити siRNA, и одна из нитей (антисмысловая по строению) в комплексе с нуклеазой специфически взаимо­действует с комплементарным (строго соответствующим ей) участком целевой мРНК, что позволяет нуклеазе разрезать ее на две части. Разрезанные участки мРНК далее подвергаются действию других клеточных РНК-нуклеаз, которые доразрезают их на более мелкие куски.

Обнаруженные у растений и низших животных организмов (насекомые) siRNA являются важным звеном своеобразного "внутриклеточного иммунитета ", позволяющего распознавать и быстро уничтожать чужеродную РНК. В том случае, если в клетку проник РНК - содержащий вирус, такая система защиты не даст ему размножиться. Если же вирус содержит ДНК, система siRNA будет мешать ему производить вирусные белки (так как необходимая для этого мРНК будет распознаваться и разрезаться), и с помощью этой стратегии замедлит его распространение по организму. Установлено, что система siRNA отличается чрезвычайной разборчивостью: каждая siRNA будет распознавать и уничтожать только свою, специфическую мРНК. Замена всего лишь одного нуклеотида внутри siRNA ведет к резкому снижению эффекта интерференции. Ни один из блокаторов генов, известных до сих пор, не обладает такой исключительной специфичностью по отношению к своему гену-мишени.

В настоящее время этот метод используется в основном в научных исследованиях для выявления функций различных клеточных белков. Однако потенциально он так же может быть использован и для создания лекарственных препаратов.

Открытие РНК-интерференции дало новую надежду в борьбе со СПИДом и онкологическими заболеваниями. Возможно, применяя терапию siRNA вместе с традиционной антивирусной и противораковой терапией, можно достичь эффекта потенцирования, когда два воздействия приводят к более выраженному лечебному эффекту, чем простая сумма каждого из них, применяемого по отдельности.

Для того, чтобы использовать механизм siRNA - интерференции в клетках млекопитающих для терапевтических целей, внутрь клеток нужно ввести уже готовые двухцепочечные молекулы siRNA. Однако существует целый ряд проблем, которые в настоящее время не позволяют осуществить это на практике, а тем более создать какие то лекарственные формы. Во-первых, в крови на них действует первый эшелон защиты организма, ферменты - нуклеазы , которые разрезают потенциально опасные и необычные для нашего организма двойные цепочки РНК. Во-вторых, несмотря на свое название, малые РНК все же достаточно длинны, а, главное, они несут отрицательный электростатический заряд, что делает невозможным их пассивное проникновение в клетку. И в - третьих, один из самых главных вопросов состоит в том, как заставить siRNA работать (или проникать) только в определенных ("больных") клетках, не затронув при этом здоровых? И, наконец проблема размера. Оптимальный размер таких синтетических siRNA те же 21-28 нуклеотидов. Если увеличить ее длину - клетки ответят выработкой интерферона и снижением синтеза белка. С другой стороны, если попытаться применять siRNA меньшие, чем 21 нуклеотид, резко снижается специфичность ее связывания с нужной мРНК и способность к формированию комплекса RISC. Следует отметить, что преодоление этих проблем критически важно не только для терапии siRNA, но и для генной терапии вообще.

В их решении уже сейчас достигнут некоторый прогресс. Например, ученые пытаются путем химических модификаций сделать молекулы siRNA более липофильными , то есть способными растворяться в жирах, из которых состоит клеточная мембрана, и таким путем облегчить проникновение siRNA внутрь клетки. А чтобы обеспечить специфичность работы внутри только лишь определенных тканей, генные инженеры включают в состав своих конструкций специальные регуляторные участки, которые активизируются и запускают считывание информации, заключенной в подобной конструкции (а значит, и siRNA, если она туда включена), только в клетках определенных тканей.

Так исследователи из Медицинской Школы в Сан-Диего при Калифорнийском Университете (University of California, San Diego School of Medicine) разработали новую эффективную систему доставки малых интерферирующих РНК (siRNA), подавляющих продукцию определенных белков, в клетки. Эта система должна стать основой технологии специфической доставки лекарственных препаратов в различные типы раковых опухолей. «Малые интерферирующие РНК, осуществляющие процесс так называемой РНК-интерференции, обладают невероятным потенциалом для лечения рака», объясняет профессор Стивен Доуди (Steven Dowdy), руководивший исследованием: «и, хотя нам предстоит еще очень много сделать, на данный момент мы разработали технологию доставки препаратов в популяцию клеток – как первичной опухоли, так и метастазов, не повреждая при этом здоровые клетки».

Многие годы Доуди и его коллеги занимались изучением противоракового потенциала малых интерферирующих РНК. Однако обычные siRNA – крохотные отрицательно заряженные молекулы, которые из-за их свойств крайне сложно доставить в клетку. Чтобы добиться этого, ученые использовали короткий сигнальный белок PTD (peptide transduction domain). Ранее с его применением было создано более 50 «гибридных белков», в которых PTD был соединен с белками-супрессорами опухолевого роста.

Однако простое соединение siRNA с PTD не приводит к доставке РНК в клетку: siRNA заряжены отрицательно, PTD – положительно, в результате чего образуется плотный РНК-белковый конгломерат, не транспортирующийся через клеточную мембрану. Поэтому исследователи сначала соединили PTD с белковым РНК-связывающим доменом, который нейтрализовал отрицательный заряд siRNA (получив гибридный белок, названный PTD-DRBD). Такой РНК-белковый комплекс уже без труда проходит через клеточную мембрану и попадает в цитоплазму клетки, где специфически ингибирует матричные РНК белков, активирующих рост опухоли.

Чтобы выявить способность гибридного белка PTD-DRBD доставлять в клетки siRNA, ученые использовали клеточную линию, полученную из рака легких человека. После обработки клеток PTD-DRBD-siRNA было обнаружено, что наиболее восприимчивыми к siRNA являются клетки опухоли, в то время как в нормальных клетках (в качестве контроля использовались Т-клетки, эндотелиальные клетки и эмбриональные стволовые клетки), где не происходило повышенной продукции онкогенных белков, токсических эффектов не наблюдалось.

Данный метод можно подвергать различным модификациям, используя разные siRNA для подавления разных опухолевых белков – не только продуцирующихся в излишнем количестве, но и мутантных. Также возможно модифицировать терапию в случае рецидивов опухолей, которые обычно за счет новых мутаций становятся невосприимчивыми к химиотерапевтическим препаратам.

Онкологические заболевания очень вариабельны, а молекулярные характеристики белков опухолевых клеток индивидуальны для каждого пациента. Авторы работы считают, что в данной ситуации применение малых интерферирующих РНК – наиболее рациональный подход к терапии.

Длина siRNA 21-25 п.н., они образуются из дцРНК. Источником таких РНК могут быть вирусные инфекции, введенные в геном генетические конструкции, длинные шпильки в составе транскриптов и двунаправленная транскрипция мобильных элементов.
дцРНК нарезаются РНКазой Dicer на фрагменты длиной 21-25 п.н. с выступающими на 2 нуклеотида 3"-концами, после чего одна из цепей входит в состав RISC и направляет разрезание гомологичных РНК. В составе RISC присутствуют siRNA, соответствующие как плюс-, так и минус- цепям дцРНК. siRNA не имеют собственных генов и представляют собой фрагменты более длинных РНК. siRNA направляют разрезание РНК-мишени, поскольку полностью ей комплементарны. У растений, грибов и нематод в процесс подавления экспрессии генов вовлечены РНК-зависимые РНК-полимеразы, для которой siRNA служат еще и праймерами (затравками для синтеза новой РНК). Образовавшаяся дцРНК нарезается Dicer, образуются новые siRNA, которые являются вторичными. Таким образом происходит амплификация сигнала.

РНК-интерференция

В 1998 году Craig C. Mello и Andrew Fire опубликовали в Nature , в которой говорилось, что двуцепочечные РНК (дцРНК) способны подавлять экспрессию генов. Позже выяснилось, что действующее начало в этом процессе- короткие одноцепочечные РНК. Механизм подавления экспрессии генов с помощью этих РНК назван
РНК-интерференцией, а также РНК-сайленсингом. Такой механизм обнаружен у всех крупных таксонов эукариот: позвоночных и беспозвоночных животных, растений и грибов. В 2006 году за это открытие получена Нобелевская премия.
Подавление экспрессии может происходить на уровне транскрипции или посттранскрипционно. Оказалось, что во всех случаях необходим сходный набор белков и короткие (21-32 п.н.) РНК .
siRNA регулируют активность генов двумя способами. Как говорилось выше, они направляют разрезание РНК-мишеней. Это явление получило название "подавление" (quelling ) у грибов, "посттрансляционный сайленсинг генов " у растений и "РНК-интерференция " у животных. в этих процессах участвуют siRNA длиной 21-23 п.н. Другой тип воздействия- siRNA способны подавлять транскрипцию генов, содержащих гомологичные siRNA-последовательности. Это явление было названо транскрипционным сайленсингом генов (TGS) и обнаружено у дрожжей, растений и животных. siRNA направляют и метилирование ДНК, что приводит к образованию гетерохроматина и репрессии транскрипции. Лучше всего TGS изучен у дрожжей S.pombe , обнаружено, что у них siRNA встраиваются в похожий на RISC белковый комплекс, названный RITS. В его случае,как и в случае RISC, siRNA взаимодействует с белком семейства AGO. Вероятно, siRNA способна направлять этот комплекс к гену, который содержит гомологичный siRNA фрагмент. После этого белки RITS рекрутируют метилтрансферазы, в результате чего в локусе, кодирующем ген-мишень siRNA, формируется гетерохроматин, и активная экспрессия гена прекращается.

Роль в клеточных процессах

Каково же значение siRNA в клетке?
siRNA вовлечены в защиту клетки от вирусов, репрессию трансгенов, регуляцию некоторых генов и формирование центромерного гетерохроматина. Важная функция siRNA-подавление экспрессии мобильных генетических элементов. Такое подавление может происходить как на уровне транскрипции, так и посттранскрипционно.
Геном некоторых из вирусов состоит из ДНК, у некоторых же - из РНК, причем, РНК у вирусов может быть как одно-, так и двуцепочечной. Сам процесс разрезания чужеродной (вирусной) мРНК в этом случае происходит так же, как было описано выше, то есть путем активации комплекса ферментов RISC. Однако для большей эффективности растения и насекомые изобрели своеобразный путь усиления защитного действия siRNA. Присоединяясь к цепи мРНК, участок siRNA может с помощью комплекса ферментов DICER сначала достроить вторую цепочку мРНК, а затем разрезать ее в разных местах, создавая таким образом разнообразные "вторичные" siRNA. Они, в свою очередь, формируют RISC и проводят мРНК через все стадии, о которых шла речь выше, вплоть до ее полного уничтожения. Такие "вторичные" молекулы смогут специфично связываться не только с тем участком вирусной мРНК, к которому была направлена "первичная" молекула, но также и с другими участками, что резко усиливает эффективность клеточной защиты.

Таким образом, у растений и низших животных организмов siRNA являются важным звеном своеобразного "внутриклеточного иммунитета ", позволяющего распознавать и быстро уничтожать чужую РНК. В том случае, если в клетку проник РНК - содержащий вирус, такая система защиты не даст ему размножиться. Если же вирус содержит ДНК, система siRNA будет мешать ему производить вирусные белки (так как необходимая для этого мРНК будет распознаваться и разрезаться), и с помощью этой стратегии замедлит его распространение по организму.

У млекопитающих же, в отличие от насекомых и растений, работает и другая система защиты. При попадании в "зрелую" (дифференцированную) клетку млекопитающего чужой РНК, длина которой больше 30 п.н., клетка начинает синтез интерферона. Интерферон, связываясь со специфическими рецепторами на клеточной поверхности, способен стимулировать в клетке целую группу генов. В результате в клетке синтезируется несколько видов ферментов, которые тормозят синтез белков и расщепляют вирусные РНК. Кроме того, интерферон может действовать и на соседние, еще не зараженные клетки, блокируя тем самым возможное распространение вируса.

Как можно заметить, обе системы во многом схожи: у них общая цель и "методы" работы. Даже сами названия "interferon" и "(RNA) interference" происходят от общего корня. Но есть у них и одно очень существенное различие: если интерферон при первых признаках вторжения просто "замораживает" работу клетки, не позволяя (на всякий случай) производство многих, в том числе и "невиновных" белков в клетке, то система siRNA отличается чрезвычайной разборчивостью: каждая siRNA будет распознавать и уничтожать только свою, специфическую мРНК. Замена всего лишь одного нуклеотида внутри siRNA ведет к резкому снижению эффекта интерференции . Ни один из блокаторов генов, известных до сих пор, не обладает такой исключительной специфичностью по отношению к своему гену-мишени.

Открытие РНК-интерференции дало новую надежду в борьбе со СПИДом и онкологическими заболеваниями. Возможно, применяя терапию siRNA вместе с традиционной антивирусной терапией, можно достичь эффекта потенцирования, когда два воздействия приводят к более выраженному лечебному эффекту, чем простая сумма каждого из них, применяемого по отдельности.
Для того, чтобы использовать механизм siRNA - интерференции в клетках млекопитающих, внутрь клеток нужно ввести уже готовые двухцепочечные молекулы siRNA. Оптимальный размер таких синтетических siRNA при этом составляет те же 21-28 нуклеотидов. Если увеличить ее длину - клетки ответят выработкой интерферона и снижением синтеза белка. Синтетические siRNA могут попасть как в зараженные, так и в здоровые клетки, и снижение выработки белков в незараженных клетках будет крайне нежелательным. С другой стороны, если попытаться применять siRNA меньшие, чем 21 нуклеотид, резко снижается специфичность ее связывания с нужной мРНК и способность к формированию комплекса RISC.

Если удастся тем или иным способом доставить siRNA, обладающую способностью связываться с каким-либо участком генома ВИЧ (который, как известно, состоит из РНК), можно попытаться не допустить его встраивания в ДНК клетки хозяина. Кроме того, ученые разрабатывают пути воздействия на различные этапы размножения ВИЧ в уже зараженной клетке. Последний подход не обеспечит излечение, однако может существенно уменьшить скорость размножения вируса и дать загнанной в угол иммунной системе шанс "отдохнуть" от вирусной атаки, и самой попытаться расправиться с остатками заболевания. На рисунке те два этапа размножения ВИЧ в клетке, которые, как надеются ученые, можно заблокировать с помощью siRNA, отмечены красными крестами (этапы 4-5 - встраивания вируса в хромосому, и этапы 5-6 - сборка вируса и выход из клетки).


На сегодняшний день, правда, все вышесказанное относится лишь к области теории. На практике терапия siRNA встречается с затруднениями, обойти которые ученым пока не удается. Например, в случае антивирусной терапии именно высокая специфичность siRNA может сыграть злую шутку: как известно, вирусы обладают способностью быстро мутировать, т.е. изменять состав своих нуклеотидов. Особенно преуспел в этом ВИЧ, частота изменений которого такова, что у человека, заразившегося одним подтипом вируса, через несколько лет может быть выделен абсолютно непохожий на него подтип. В этом случае измененный штамм ВИЧ автоматически станет нечувствительным к siRNA, подобранной в начале терапии.

Старение и канцерогенез

Как и любой эпигенетический фактор, siRNA влияют на экспрессию генов, которые заставляет "молчать". Сейчас появляются работы, в которых описаны эксперименты по выключению генов, ассоциированных с опухолями. Гены выключают (knock-down) именно с помощью siRNA. Например, китайские ученые с помощью siRNA выключали ген транскрипционного фактора 4 (TCF4), активность которого служит причиной синдрома Pitt-Hopkins (очень редкое генетическое заболевание, характеризующееся умственной отсталостью и эпизодами гипервентиляции и апноэ) и других умственных заболеваний. В данной работе проводилось изучение роли TCF4 в клетках рака желудка. Эктопическая экспрессия TCF4 снижает рост клеток в линиях клеток рака желудка, выключение гена TCF4 с помощью siRNA повышает миграцию клеток. Таким образом, можно сделать вывод, что эпигенетическое выключение (сайленсинг) гена TCF4 играет важную роль в образовании и развитии опухоли.

Согласно исследованиям в Department of Oncology, Albert Einstein Cancer Center под руководством Leonard H. Augenlicht siRNA участвует в выключении гена HDAC4 , что вызывает ингибирование роста раковой опухоли толстой кишки, апоптоз и повышение транскрипции p21. HDAC4- это гистоновая деацетилаза, которая является тканеспецифичной, подавляет дифференцировку клеток и ее экспрессия подавлена в течение процесса дифференцировки клеток. В работе показано, что HDAC4 является важным регулятором пролиферации клеток толстой кишки (что имеет значение при раковом процессе), а ее в свою очередь регулируют siRNA.

В Department of Pathology, Nara Medical University School of Medicine в Японии проводились исследования рака простаты. Репликативное старение клеток- это барьер против неконтролируемого деления и канцерогенеза. Короткоживущие делящиеся клетки (TAC) являются частью популяции клеток простаты, из которой и образуется опухоль. Японские ученые изучали причины, по которым эти клетки преодолевают старение. В клетки простаты в культуре были трасфецированы junB siRNA. В этих клетках наблюдается повышенный уровень экспрессии p53, p21, p16 и pRb, выявляемый при старении. Клетки в культуре, которые показали пониженный уровень p16, использовались для следующего этапа. Повторная трансфекция siRNA в TAC позволила клеткам избежать старения при инактивации p16/pRb. Кроме того сайленсинг прото-онкогена junB с помощью junB siRNA вызывает инвазию клеток. На основании этого был сделан вывод, что junB является элементом для p16 и способствует клеточному старению, препятствующему малигнизации (озлокачествлению)TAC. Таким образом, junB является регулятором канцерогенеза в простате и может быть целью для терапевтического воздействия. А регулировать его активность можно с помощью siRNA.

Подобных исследований проводится огромное множество. В настоящее время siRNA- это не только объект, но и инструмент в руках исследователя- врача, биолога, онколога, геронтолога. Исследование связи siRNA с онкологическими заболеваниями, с экспрессией возраст-ассоциированных генов- это важнейшая задача для науки. Прошло совсем немного времени с момента открытия siRNA, а сколько появилось интересных исследований и публикаций, связанных с ними. Можно не сомневаться, что их изучение станет одним из шагов человечества к победе над раком и старением...

А.М. Дейчман, С.В.Зиновьев, А.Ю.Барышников

ЭКСПРЕССИЯ ГЕНОВ И МАЛЫЕ РНК В ОНКОЛОГИИ

ГУ РОНЦ им. Н.Н.Блохина РАМН, Москва

РЕЗЮМЕ

В статье представлена роль малых РНК, контролирующих большинство жизненно важных функций клетки и организма, и возможная связь их, в частности, с онкогенезом и другими (включая гипотетические) внутриклеточными механизмами геномной экспрессии.

Ключевые слова : малые РНК, интерференция РНК (РНКи), двунитевая РНК (днРНК), редактирование РНК, онкогенез.

A.M. Deichman , S.V.Zinoviev, A.Yu.Baryshnikov.

THE GENE EXPRESSION AND SMALL RNAS IN ONCOLOGY

N.N. Blokhin Russian Cancer Research Center RAMS, Mosc ow

ABSTRACT

In the paper role of small RNAs supervising the majority vital functions of cell and organism and possible connection of them in particular with oncogenesis and others (including hypothetical) intracellular mechanisms of genome expression is submitted.

Key words : Small RNAs, interference RNAs (RNAi), double strand RNAs (dsRNAs), RNA editing, tumorogenesis.

Введение

Экспрессия отдельных генов и целых геномов эукариот, включая процессинг, различные виды транскрипции, сплайсингов, перестановок, редактирования РНК, рекомбинаций, трансляцию, интерференцию РНК, регулируется некоторыми белками (продуктами регуляторных, структурных, гомеозисных генов, транскрипционными факторами), подвижными элементами, РНК и низкомолекулярными эффекторами. Среди процессирующих РНК – рРНК, тРНК, мРНК, некоторые виды регуляторных РНК и малые РНК.

К настоящему времени известно, что малые РНК не кодируют белок, часто исчисляются сотнями на геном и участвуют в регуляции экспрессии различных эукариотических генов (соматических, иммунных, герминативных, стволовых клеток). Под контролем оказываются процессы дифференцировки, (гематопоэз, ангиогенез, адипогенез, миогенез, нейрогенз), морфогенеза (включая эмбриональные стадии, развитие/рост, физиологическую регуляцию), пролиферации, апоптоза, канцерогенеза, мутагенеза, иммуногенеза, старения (продления жизни), эпигенетического сайленсинга ; отмечены случаи метаболической регуляции (например, гликосфинголипидов ). Более широкий класс некодирующих РНК в 20-300/500 нуклеотидов и их РНП обнаружены не только в ядре/ядрышке/цитоплазме , но и в ДНК-содержащих клеточных органеллах (митохондриях животных ; у растений найдены микро-РНК и консенсусные к транскриптам хлоропластов последовательности малых РНК ).

Для управления и регуляции в.н. процессами важно: 1. что небольшие по размерам естественные/искусственные РНК (малые РНК, тРНК, подобн.) и их комплексы с белками (РНП) способны к чрезмембранному клеточному и митохондриальному транспорту ; 2. что после распада митохондрий часть их содержимого, РНК и РНП, могут оказаться в цитоплазме и ядре. Перечисленные свойства малых РНК (РНП), функционально значимая роль которых в процессе изучения только увеличивается, очевидно, имеют связь с фактором настороженности в отношении рака и других генетических заболеваний . Одновременно прояснилась высокая значимость эпигеномных моди-фикаций хроматина при возникнове-нии опухолей . Мы рассмотрим только очень ограниченное число случаев из множества подобных.

Малые РНК

Механизм действия малых РНК состоит в способности их почти комплементарно связыватьтся с З"-нетранслируемыми областями (З"-НТО) мРНК-мишеней (которые иногда содержат ДНК-/РНК-транспозирующие MIR/LINE-2-элементы, а также консервативные Alu-повторы) и вызывать интерференцию РНК (РНКи=RNAi; в частности, при антивирусном ответе) . Осложнение, однако, в том, что кроме клеточных существуют и вирус-кодируемые малые РНК (герпеса, SV40, др.; EBV, например, содержит 23, а KSHV – 12 miRNAs ), взаимодействующие с транскриптами и вируса и хозяина. Одних только клеточных/вирусных miRNAs известно более 5 тысяч у 58 видов . РНКи инициирует либо деградацию (с участием комплекса RISC, RNA-Induced Silencing Complex) по уязвимым для нуклеаз фрагментам непрерывных спиралей днРНК (двунитевых РНК мРНК, др.), либо частично обратимое ингибирование прерывисто спирализованных днРНК при трансляции мРНК-мишеней. Зрелые малые РНК (~15-28 нуклеотидов) образуются в цитоплазме из своих процессирующих в ядре предшественников различной длины (в десятки и сотни нуклеотидов) . Кроме того, малые РНК участвуют в формировании сайленсиноговой структуры хроматина, регуляции транскрипции отдельных генов, подавлении экспрес-сии транспозонов и поддержании функциональной структуры протяженных участков гетерохроматина .

Различают несколько основных видов малых РНК. Наиболее хорошо изучены микро-РНК (miRNAs) и малые интерферирующие РНК (siRNAs). Кроме того, среди малых РНК изучаются: активные в герминативных клетках piRNAs ; малые интерферирующие РНК, ассоциированные с эндогенными ретротранспозонами и повторяющимися элементами (при локальной/глобальной гетерохроматизации – начиная с ранних стадий эмбриогенеза; поддерживают уровень теломер), rasiRNAs дрозофиы ; часто кодируемые интронами белковых генов и функционально важные при трансляции, транскрипции, сплайсинге (де-/метилировании, псевдоуридилировании нуклеиновых кислот) малые ядерные (snRNAs) и ядрышковые (snoRNAs) РНК ; комплементарные ДНК-связывающим NRSE-(Neuron Restrictive Silenser Element)-мотивам малые модуляторные РНК, smRNAs, с малоизвестными функциями ; трансактивирующие малые интерферирующие РНК растений, tasiRNAs ; короткие шпилечные РНК, shRNAs, обеспечивающие долговременную РНКи (устойчивый генный сайленсинг) длинных днРНК-структур при антивирусном ответе у животных .

Малые РНК (miRNAs, siRNAs, др.) взаимодействуют с новосинтезируемыми транскриптами ядра/цитоплазмы (регулируя сплайсинг, трансляцию мРНК; метилирование/псевдоуридилирование рРНК, др.) и хроматина (при временно-локальной и эпигенетически наследуемой гетерохроматинизации делящихся соматических герминативных клеток) . Гетерохроматинизация, в частности, сопровождается де-/метилированием ДНК, а также метилированием, ацетилированием, фосфорилированием и убиквитинированием гистонов (модификация «гистонового кода») .

Первыми среди малых РНК были обнаружены и исследованы miRNAs нематоды Caenorhabditis elegans (lin-4), их свойства и гены , а несколько позже – miRNAs растения Arabidopsis thaliana . В настоящее время их связывают с многоклеточными организмами , хотя они показаны у одноклеточной водоросли Chlamydomonas reinhardtii , а РНКи-подобные пути сайленсинга, в связи с противовирусной/подобной защитой с участием т.н. psiRNAs, обсуждаются для прокариот . Геномы многих эукариот (в том числе дрозофилы, человека) содержат несколько сотен генов miRNAs. Эти стадио-/тканеспецифичные гены (как и соответствующие им участки мРНК-мишеней) часто высокогомологичны у филогенетически отдаленных видов, но некоторые из них – линиоспецифичны . miRNAs содержатся в экзонах (белок-кодирующих, РНК-генов), интронах (чаще всего пре-мРНК), межгенных спейсерах (включая повторы), имеют длину до 70-120 нуклеотидов (и более) и формируют шпилечные структуры типа петля/стебель . Для определения их генов используют не только биохимические и генетические, но и компьютерные подходы .

Наиболее характерная длина «рабочего участка» зрелых miRNAs – 21-22 нуклеотида. Возможно, это самые многочисленные среди не кодирующих белки генов. Они могут располагаться в виде отдельных копий (чаще) или кластеров, содержащих множество сходных или различных генов miRNAs, транскрибирующихся (не редко с автономных промоторов) в виде более длинного предшественника, процессируемого в несколько стадий до индивидуальных miRNAs . Предполагают, что существует регуляторная miRNA-сеть, контролирующая множество фун-даментальных биологических процессов (включая онкогенез/метастазирование); вероятно, не менее 30% экспрессируемых генов человека регулируются miRNAs .

В этом процессе участвуют днРНК-специфические РНКаза-III-подобные ферменты Drosha (ядерная рибонуклеаза; инициирует процессинг интронных пре-miRNAs после сплайсинга основного транскрипта) и Dicer, функционирующий в цитоплазме и расщепляющий/деградирующий, соответственно, шпилечные пре-miRNAs (до зрелых miRNAs) и образуемые позже гибридные miRNAs/мРНК структуры. Малые РНК, вместе с несколькими белками (включая в.н. РНКазы, белки AGO-семейства, трансметилазы/ацетилазы, др.) и с участием т.н. RISC- и RITS-подобных комплексов (второй – индуцирует транскрипционный сайленсинг), способны, соответственно, вызывать РНКи/деградацию и последующий генный сайленсинг на РНК- (до/при трансляции) и ДНК- (при транскрипции гетерохроматина) уровнях.

Каждая miRNA потенциально спаривается со множеством мишененй, а каждая мишень – контролируется рядом miRNAs (что напоминает gRNAs-опосредуемое редактирование пре-мРНК в кинетопластах трипаносом). Анализ in vitro показал, что miRNAs-регуляция (как и редактирование РНК) – ключевой посттранскрипционный модулятор экспрессии генов. Сходные miRNAs, конкурирующие за одну мишень – потенциальные трансрегуляторы РНК-РНК и РНК-белковых взаимодействий.

У животных miRNAs наиболее хорошо изучены для нематоды Caenorhabditis Elegans; описано более 112 генов. Здесь обнаружены и тысячи эндогенных siRNAs (генов нет; связаны, в частности, со сперматогенез-опосредуемыми транскриптами и транспозонами ). Обе малых РНК многоклеточных могут генерироваться РНК-полимеразами, проявлющими активность (не гомологию) RdRP-II (как для большинства других РНК) и RdRP-III типов . Зрелые малые РНК схожи по составу (влючая концевые 5"-фосфаты и З"-ОН), длине (обычно 21-22 нуклеотида) и функции, и могут конкурировать за одну мишень . Однако РНК-деградацию, и при полной комплементарности мишени, чаще ассоциируют с siRNAs; трансляционную репрессию, при частичной, обычно в 5-6 нуклеотидов, комплементарности – с miRNAs; а предшественники, соответственно, экзо-/эндогенные (в сотни/тысячи нуклеотидов) для siRNAs, и обычно эндогенные (в десятки/сотни нуклеотидов) для miRNAs и биогенез у них различны ; впрочем, в некоторых системах эти различия обратимы.

РНКи, опосредуемая siRNAs- и miRNAs, имеет разнообразные естественные роли: от регуляции экспрессии генов и гетерохроматина – до защиты генома против транспозонов и вирусов; но siRNAs и часть miRNAs не консервативны между видами. У растений (Arabidopsis thaliana) обнаружены: siRNAs, соответствующие как генам, так и межгенным (включая спейсеры, повторы) областям; огромное число потенциальных сайтов генома для различных типов малых РНК . У нематод открыты также т.н. изменчивые автономно экспрессируемые 21У-РНК (dasRNAs); они имеют 5"-У-монофосфат, составляют 21 нукдеотид (20-ть из них изменчивы), и располагаются между или внутри интронов белок-кодирующих генов по более чем 5700 сайтам двух областей IV хромосомы .

MiRNAs играют важную роль при экспрессии генов в норме и патологии; у человека – не менее 450-500 таких генов . Связываясь обычно с З"-НТО-областями мРНК (др. мишенями), они могут избирательно и количественно (в частности, при выведении из оборота продуктов низкоэкспрессируемых генов ), блокировать работу одних и активность других генов. Оказалось, что наборы профилей экспрессируемых микро-РНК (и их мишеней) динамически меняются в процессе онтогенеза, дифференцировки клеток и тканей. Эти изменения специфичны, в частности, при кардиогенезе , процессе оптимизации размеров длины дендритов и числа синапсов нервной клетки (с участием miRNA-134, др. малых РНК) , развитии многих патологий (онкогенезе, иммунодефицитах , генетических заболеваниях , паркинсонизме , болезни Альцгеймера , офтальмологических нарушениях (ретинобластома , др.), связаных с инфекциями различной природы ). Общее число обнаруживаемых miRNAs растет много быстрее, чем описание их регуляторной роли и связи с конкретными мишенями.

Компьютерный анализ предсказывает сотни мРНК-мишеней для отдельных miRNAs и регуляцию индивидуальных мРНК множеством miRNAs. Таким образом miRNAs могут служить целям элиминации транскриптов генов-мишеней, либо тонкой настройки их экспрессии на траскрипционном/трансляционном уровнях. Теоретическое рассмотрение и экспериментальные результаты подтверждают существование разнообразных ролей miRNAs.

Более полный перечень аспектов, связанных с фундаментальной ролью малых РНК у эукариот в процессах роста/развития и при некоторых патологиях (включая эпигеномику рака), отражены в обзоре .

Малые РНК в Онкологии

Процессы роста, развития, прогрессии и метастазирования опухолей сопровождаются множеством эпигенетических изменений, перерастающих в более редкие стойко-наследемые генетические изменения . Редкие мутации, однако, могут иметь большой вес (для конкретных индивида, нозологии), т.к. в отношении отдельных генов (например APC, K-ras, p53) возможен т.н. эффект «воронки», связанный с почти необратимыми развитием/последствиями онкозаболеваний. Опухолеспецифическая в отношении профиля экспрессии различных генов (белков, РНК, малых РНК) гетерогенность клеток-предшественников обусловливается сопряженными вариациями перестраиваемых эпигеномных структур. Эпигеном модулируется метилированием, посттрансляци-онными модификациями/заменами гистонов (на неканонические), ремоделингом нуклеосомной структуры генов/хроматина (включая геномный импринтинг, т.е. дисфункцию экспрессии аллелей родительских генов и Х-хромосом). Все это, и с участием РНКи, регулируемой малыми РНК, ведет к появлению дефектных гетерохроматиновых (включая гипометилированные центромерные ) структур .

Формированию ген-специфических мутаций может предшествовать известное накопление сотен тысяч соматических клональных мутаций в простых повторах или микросателлитах некодирующей (редко – кодирующей) области – по крайней мере в опухолях с микросателлитным мутаторным фенотипом (MMP) ; они составляют значительную часть колоректальных, а также раков легких, желудка, эндометрия, др. Нестабильные моно-/гетеронуклеотидные микросателлитные повторы (поли-А6-10, подобн.) содержатся во много раз чаще в контролирующих экспрессию генов регуляторных некодирующих (интроны, межгенно), чем в кодирующих (экзоны) областях генома микросателлит-нестабильных, MSI+, опухолей. Хотя природа появления и механизмы локализации MS-стабильных/нестабильных областей до конца не ясны, формирование MS-нестабильности коррелировало с частотой мутаций множества ранее не мутирующих в MSI+-опухолях генов и, вероятно, канализировало пути их прогрессии; причем частота мутаций MSI-повторов в этих опухолях увеличивалась более чем на два порядка . Не все гены проанализированы на наличие повторов, но степень мутабильности их в кодирующих/некодирующих областях различна, а точность методов определения частоты мутаций – относительна . Важно, что некодирующие области по MSI-мутабильным повторам часто биаллельны, а кодирующие – моноаллельны .

Глобальное снижение метилирования в опухолях характерно для повторов , мобильных элементов (МЭ; их транскрипция увеличивается), промоторов, CpG-сайтов опухолесупрессорных miRNA-генов и коррелирует с гипертранскрипцией ретротранспозонов в клетках прогрессирующих раков . В норме колебания «метилома» связаны с родительско-/стадио-/тканеспецифическими «волнами метилирования» и сильным метилированием центромерных сателлитных участков гетерохроматина, регулируемых малыми РНК. При недометилировании сателлитов формируемая нестабильность хромосом сопровождается усилением рекомбинации , а наруше-ние метилирования МЭ может запускать их экспрессию . Эти факторы благоприятствует развитию опухолевого фенотипа. Терапия малыми РНК может быть высокоспецифичной, но должна быть контролируемой, т.к. мишенями могут оказаться не только отдельные, но и множество мРНК/РНК молекул, и новосинтезируемые РНК различных (включая некодирующие межгенные повторы) областей хромосом .

Большую часть генома человека составляют повторы и МЭ. Ретротранспозон L1 (LINE элемент) содержит, как и эндогенные ретровирусы, ревертазу (RTase), эндонуклеазу и потенциально способен переносить неавтономные (Alu, SVA, др.) ретроэлементы ; сайленсинг L1/подобных элементов осуществляется в результате метилирования по CpG-сайтам . Заметим, что среди CpG-сайтов генома слабо метилированы CpG-островки промоторов генов, а сам 5-метилцитозин – потенциально мутагенное основание, дезаминируемое в тимин (химически, или при участии редактирования РНК/(ДНК), репарации ДНК); однако некоторые из CpG-островков подвержены избыточному аберрантному метилированию, сопровождаемому репрессией генов-супрессоров и развитию рака . Далее: РНК-связывающий белок, кодируемый L1, взаимодействуя с бел-ками AGO2 (семейства Argo-naute) и FMRP (fragile mental retardation, белок эффекторного RISC-комплекса ), способствует перемещению L1-элемента – что указывает на возможную взаиморегуля-цию систем РНКи и ретропозиции LINE элементов человека. Важно, в частности, что Alu-повторы способны перемещаться в область интрон/экзонного пространства генов .

Эти и подобные механизмы могут усиливать патологическую пластичность генома опухолевой клетки. Подавление RTase (кодируемой, как и эндонуклеаза, элементами L1; RTase также кодируется и эндогенными ретровирусами) по механиз-му РНКи сопровождалось снижением пролиферации и усилением дифференцировки в ряде раковых клеточных линий . При внедрении L1 элемента в протоонкоген или супрессорный ген наблюдали двунитевые разрывы ДНК . В тканях зародышевого пути (мышей/человека) уровень экспрессии L1 повышен, а его метилирование зависело от piRNAs-(26-30-п.о.)-связанной системы cайленсинга, где PIWI-белки – варианты большого семейства белков Argo-naute, мутации в которых ведут к деметилированию/дерепрессии L1/подобных элементов с длинными концевыми повторами. С PIWI-белками же в большей степени, чем с Dicer-1/2 и Ago-белками, связаны пути сайленсинга rasiRNAs . Опосредуемые piRNAs/siRNAs пути сайленсинга реализуются через внутриядерные тельца, содержащие крупные эволюционно-консервативные мультибелковые РсG-комплексы, функции которых в опухолевых клетках часто нарушаются. Эти комплексы отвечают за дальнодействие (через более чем 10 т.п.о., между хромосомами) и регулируют кластер генов HOX, ответ-ственных за план строения тела .

Но-вые принципы антисенс-терапии могут развиваться с учетом знаний о более высокоспецифичных (чем гистонмодифицирующие ингибиторы метилирова-ния ДНК/белков) противоопухолевых эпигеномных агентах, фундаментальных основ эпигеномного РНК-сайленсинга и роли малых РНК в канцеро-генезе .

Микро-РНК в Онкологии

Известно, что усиление опухолевого роста и метастазирования могут сопровождаться повышением одних и понижением экспрессии других индивидуальных/наборов miRNAs (табл. 1). Некоторые из них могут иметь причинную роль в онкогенезе; и даже одни и те же miRNAs (как miR-21/-24) в разных опухолевых клетках могут проявлять как онкогенные, так и супрессирующие свойства. Каждый тип злокачественных опухолей человека хорошо различим своим «miRNA-отпечатком», и некоторые miRNAs могут функционировать как онкогены, опухолевые супрессоры, инициаторы клеточной миграции, инвазии, метастазирования . В патологически измененных тканях часто обнаруживают пониженное количество ключевых miRNAs, вероятно включенных в системы противораковой защиты. Участвующие в онкогенезе miRNAs (miRs) сформировали представ-ление о т.н. «онкомирах» : анализ экспрессии более 200 miRNAs свыше 1000 образ-цов лимфом и со-лидных раков позволил успешно классифицировать опухоли на подтипы по их происхожде-нию и стадии дифференцировки . Функции и роль miRNAs успешно изучают с помощью: анти-miR-олигонуклеотидов, модифицирован-ных (для увеличения времени жизни) по 2"-О-метильным и 2"-О-метоксиэтильным группам ; а также LNA-олигонуклеотидов, в которых кислородные атомы рибозы в положениях 2" и 4" соединены метиленовым мос-тиком .

(табл. 1)……………….

Опухоль	miRNAs
Рак легких	17-92 , let-7↓ , 124a↓ , 126 ↓ , 143 ↓ , 145 ↓ , 155 , 191 , 205 , 210
Рак молочной железы	21 , 125b↓ , 145 ↓ , 155
Рак простаты	15a ↓ , 16-1 ↓ , 21 , 143 ↓ ,145 ↓
Рак кишечника	19a , 21 , 143 ↓ , 145 ↓
Рак поджелудочной железы	21 , 103 , 107 , 155 v
Рак яичника	210
Хроническая лимфоцитарная лейкемия	15a ↓ , 16-1 ↓ , 16-2 , 23 b , 24-1 , 29 ↓ , 146 , 155 , 195 , 221 , 223 ↓

Таблица 1 .

miRNAs, экспрессия которых увеличивается () или уменьшается (↓ ) в некоторых наиболее распространенных опухолях по сравнению с нормальными тканями (см. , а также ).

Считается, что регулирующая роль экспрессии, исчезновения и амплификации miRNA-генов в предрасположенности к инициации, росту и прогрессии большинства опухолей значительна, а мутации в парах miRNA/мРНК-мишень синхронизированы . Профиль экспрессии miRNAs может использоваться для классификации, диагностики и клинического прогноза в онкологии. Изменения в экспрессии miRNAs могут затрагивать клеточный цикл, программу выживаемости клетки . Мутации miRNAs в стволовых и соматических клетках (как и выбор полиморфных вариантов мРНК-мишеней) могут способствовать, или даже играть критическую роль при росте, прогрессии и патофизиологии многих (если не всех) злокачественных новообразований . С помощью miRNAs возможна коррекция апоптоза .

Кроме индивидуальных miRNAs обнаружены их кластеры, выступающие в роли онкогена, провоцирующего развитие, в частности, рака кроветворной ткани у подопытных мышей; гены miRNAs с онкогенными и супрессорными свой-ствами могут располагаться в одном кластере. Кластерный анализ профилей экспрессии miRNAs в опухолях позволяет определить ее происхождение (эпителий, кроветворная ткань, др.) и классифицировать разные опухоли одной ткани с неидентичными ме-ханизмами трансформации . Оценку профиля экспрессии miRNAs можно осуществлять с исполь-зованием нано-/микрочипов; точность такой классификации, при отработке технологии (что не просто), оказывается выше, чем с использова-нием профилей мРНК . Некоторые из miRNAs участвуют в дифференцировке гематопоэтических клеток (мышь, человек), инициации прогрессии раковых клеток . Человеческие miRNA-гены часто располагаются в т.н. «ломких» сайтах, областях с преобладанием делеций/вставок, точечных разрывов, транслокаций, транспозиций, минимально делетируемых и амплифицируемых областей гетерохроматина, вовлеченных в онкогенез .

Ангиогенез . Роль miRNAs в ангиогенезе, вероятно, значительна. Усиление ангиогенеза в некоторых Myc-активированных аденокарциномах человека сопровождалось изменением характера экспрессии одних miRNAs, а нокдаун генов других miRNAs вел к ослаблению и подавлению роста опухоли . Рост опухоли сопровождался мутациями в K-ras, Myc и TP53 генах, усилением продукции ангиогенного VEGF-фактора и степени Myc-ассоциированной васкуляризации; при этом антиангиогенные факторы Tsp1 и CTGF подавлялись miR-17-92 и др. кластер-ассоциированными miRNAs. Ангиогенез и васкуляризация опухоли усиливались (в частности, в колоноцитах) при коэкспрессии двух онкогенов в большей степени, чем одним .

Нейтрализация антиангиогенного LATS2 фактора, ингибитора циклинзависимой киназы животных (CDK2; человек/мышь), с помощью miRNAs-372/373 («потенциальные онкогены») стимулировала рост опухоли семенников без повреждения р53-гена .

Потенциальными модуляторами ангиогенных свойств (in-vitro/in-vivo) являются miR-221/222, мишени которых, рецепторы c-Kit (др.), – факторы ангиогенеза эндотелиальных венозных HUVEC клеток пуповины, др. Эти miRNAs и c-Kit взаимодействуют в рамках сложного цикла, контролирующего способность эндотелиальных клеток к формированию новых капилляров .

Хронический лимфолейкоз (СLL). При В-клеточном хроническом лимфолейкозе (СLL) отмечают пониженный уровень экспрессии генов miR-15a/miR-16-1 (и др.) в 13q14 участке хромосомы человека – сайте наиболее общих структурных аномалий (включая делеции участка в 30kb), хотя геном экспрессировал сотни зрелых и пре-miRNAs человека . Обе потенциально эффективные при терапии опухолей miRNAs содержали антисенс-участки антиапоптического белка Bcl2, подавляли его сверх-/экспрессию, стимулировали апоптоз, но почти/полностью отсутствовали в двух третях «отбившихся» от нормы CLL-клеток. Идентифицированы частые мутации секвенированных miRNAs в стволовых/соматических клетках у 11 из 75 пациентов (14.7%) с семейной предрасположенностью к CLL (способ наследования неизвестен), но не у 160 здоровых пациентов. Эти наблюдения вызывают предположение о прямом функционировании miRNAs в лейкемогенезе . В настоящее время не все известно о связи уровней экспрессии генов miRNAs (и их функций) и других генов в нормальных/опухолевых клетках .

Документ

Актуальность. Нарушение функции лицевого нерва при выполнении оперативного вмешательства на околоушной слюнной железе является одной из актуальных проблем и определяется как распространённостью заболевания, так и значительной частотой

Доусон черч - гений в ваших генах эпигенетическая медицина и новая биология намерения книга из библиотеки www e - puzzle ru книга из библиотеки www e - puzzle ru оглавление

Книга

Этика духовность онкология вич п гаряев* а энфи резюме

Документ

В настоящей статье отражён новый взгляд на проблему онкологии и ВИЧ-инфекции в свете Лингвистико-Волновой Генетики (ЛВГ) и Теории Сущностного Кодирования (ТСК) на материале российских и других социо-культурных реалий.

Онкологический научный центр и блохина одинцова анастасия сергеевна новые режимы химиотерапии распространенного и рецидивирующего рака шейки матки 14 01 12 – онкология

Диссертация

4.4. Определение гена изофермента уридинглюкоронилтрансферазы (UGT1A1) в сыворотке крови больных РШМ, получавших химиотерапию I линии иринотеканом с производными платины 105